吉林农业大学研究生()-考研培训网

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金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性菌，是人体微生物群的一部分，也是引起食物中毒、菌血症、心内膜炎、骨髓炎、皮肤和软组织感染的主要原因，由于其可以定植在人体内，当宿主机体免疫紊乱时，作为内源性致病菌可能会引起更严重的感染。致病菌侵入肠道的第1步是黏附，继而定植到肠道，在局部产生毒素或者直接侵入组织，引起宿主细胞出现形态结构和生理功能的变化，从而引发疾病。

大量研究表明，乳酸菌可以在体内外很好地抑制致病菌黏附和定植于人体肠道上皮细胞，从而达到治疗致病菌感染的作用。吉林农业大学食品科学与工程学院的杨乐、杨柳、任大勇*等以一株前期筛选得到的促进金黄色葡萄球菌黏附的唾液乳杆菌CICC 23174为研究对象，试图从膜外蛋白角度研究其促进金黄色葡萄球菌黏附的机制，为乳酸菌安全性评价以及乳酸菌的科学使用提供依据。

1、重组菌E. coli BL21（DE3）的制备及EF-G纯化验证结果

PCR扩增后1%琼脂糖凝胶电泳验证，ef-g基因正确克隆。pET-ef-g重组质粒导入E. coli BL21（DE3）中，卡那霉素筛选，PCR扩增1%琼脂糖凝胶电泳验证。经IPTG诱导重组E. coli BL21（DE3）菌株大量表达EF-G，EF-G蛋白分子质量约为77 kDa，EF-G条带位于66.4～97.2 kDa之间，表明EF-G正确表达。

2、EF-G对金黄色葡萄球菌黏附性的影响

由图2可知，加入0.15 mg/mL EF-G后金黄色葡萄球菌黏附数量明显增多，表明EF-G促进了金黄色葡萄球菌的黏附。通过番红染液对黏附性作初步评价，再通过测定OD492 nm对黏附性变化进行定量分析。由图3可知，先加入EF-G将金黄色葡萄球菌黏附率提高了43%（n=6，P＜0.05），同时加入EF-G使金黄色葡萄球菌黏附率提高了40%（n=6，P＜0.05），对比两组结果，先加入EF-G时，金黄色葡萄球菌黏附数量更多，可能是因为EF-G是金黄色葡萄球菌黏附的特异性识别位点，EF-G与金黄色葡萄球菌混合加入时蛋白占据了金黄色葡萄球菌表面的黏附位点，使金黄色葡萄球菌黏附率降低。

3、pNZ-ef-gsx基因敲除载体的构建及唾液乳杆菌Δef-g菌株的制备

pNZ-ef-gsx重组质粒验证结果显示pNZ-ef-gsx敲除载体构建成功。通过同源重组的方法将ef-g用氯霉素基因替换，先通过红霉素抗性筛选，再通过氯霉素抗性筛选，多次传代培养消除敲除载体，提取基因组，进行测序、PCR和SDS-PAGE验证，图4表明唾液乳杆菌Δef-g菌株构建成功。

4、唾液乳杆菌Δef-g对金黄色葡萄球菌体外黏附的影响

由图5可知，唾液乳杆菌Δef-g组颜色较唾液乳杆菌组颜色浅，结果表明唾液乳杆菌Δef-g组黏附菌少。与番红染色观察结果一致，如图6所示，与唾液乳杆菌相比，实验组1的金黄色葡萄球菌黏附率降低了40%，实验组2的金黄色葡萄球菌黏附率降低了34%，结果表明EF-G能够促进金黄色葡萄球菌黏附。

5、唾液乳杆菌Δef-g对金黄色葡萄球菌体内黏附的影响

唾液乳杆菌Δef-g体内黏附实验结果

对比图7A、B可知，唾液乳杆菌Δef-g和唾液乳杆菌数量大致相同，表明EF-G对唾液乳杆菌黏附定植肠道没有影响。

唾液乳杆菌Δef-g促进致病菌黏附实验结果

对比图8A、B可知，唾液乳杆菌Δef-g组黏附金黄色葡萄球菌数量较唾液乳杆菌组少，表明唾液乳杆菌EF-G促进金黄色葡萄球菌黏附。

金黄色葡萄球菌黏附的定量分析结果

如图9A、C所示，唾液乳杆菌和唾液乳杆菌Δef-g在小鼠肠道内数量大致相同，结果表明ef-g基因对唾液乳杆菌黏附定植肠道无影响；如图9B、D所示，唾液乳杆菌组黏附金黄色葡萄球菌数量较唾液乳杆菌Δef-g组多，与唾液乳杆菌组相比，唾液乳杆菌Δef-g组金黄色葡萄球菌黏附率降低了20%，表明EF-G促进唾液乳杆菌黏附金黄色葡萄球菌。

扫描电子显微镜观察唾液乳杆菌Δef-g体内促金黄色葡萄球菌黏附效果