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造血祖细胞激酶 (Hematopoietic Progenitor Kinase1，HPK1)是一种免疫抑制调节激酶，是T细胞受体(TCR)的负信号调节剂。抑制HPK1激酶的活性可以增加细胞因子的分泌，增强T细胞信号传导，增强机体的抗肿瘤免疫反应，将“冷肿瘤”转化为“热肿瘤”，从而提高现有免疫治疗手段的应答率。因此，HPK1抑制剂有望成为肿瘤免疫治疗的新星和免疫检查点抑制剂的新搭档。
图1. 已报道HPK1小分子抑制剂
GLK与HPK1同属MAP4K家族，氨基酸序列高度同源但功能相反，GLK是TCR受体信号的正调控因子，因此实现GLK的选择性对于HPK1抑制剂的设计是至关重要。目前已公开报道结构的HPK1抑制剂中仅有化合物4对GLK表现出了良好的选择性（>30倍），但其人肝微粒体代谢稳定性差，未能进入临床开发阶段（图1）。因此， GLK选择性和成药性是HPK1抑制剂开发面临的两大挑战，
图2. 化合物4对HPK1和GLK的选择性机制及构象限制策略
近日，华中师范大学黄伟、杨光富研究团队基于大环化的构象限制策略首次报道了兼具选择性和成药性的新型HPK1抑制剂。研究人员首先通过对化合物4的选择性机制研究发现，在小分子结合口袋的入口，即溶剂前沿区域，HPK1和GLK表现出了不同的构象。GLK结合口袋的入口相对较窄，位于溶剂前沿区域的苯基更容易与GLK发生空间冲突，进而产生选择性（图2A）。然而，化合物4可以通过构象调整来适合GLK的活性口袋，故对GLK的选择性仅为30-50倍。研究人员进而提出了大环化的构象限制策略，将化合物4的U型构象限制在有利于与HPK1结合的活性构象中，同时有效地阻止大环化后的分子通过构象调整来适应其他激酶的结合口袋，从而增加对GLK等激酶的选择性（图2B）。
图3. 基于大环化构象限制的选择性HPK1抑制剂的设计
基于合成可行性和结构改造空间的综合考量，研究人员以更稳定的氰基简化和替代代谢稳定性差的五元内酯环；将苯基上的3位和苯甘酚上的2位做为大环化的连接位点；同时将恶二唑环骨架跃迁为激酶抑制剂的优势片段吡唑环。通过系统的构效关系和成药性研究，成功发现了新型大环类HPK1抑制剂5i（图3）。
化合物5i体外活性优异（IC50，HPK1为0.8 nM），GLK选择性高（101.3倍），明显优于化合物4，同时对IRAK4等其它激酶的选择性也有了一定提高。此外，化合物5i的人体肝微粒体代谢稳定性较化合物4得到了大幅提升（T1/2分别为57.7 min和>186.4 min），并表现出理想的大鼠和比格犬体内PK性质（F = 27-49%）。
图4. 化合物5i单药和与anti-PD-1联用时的抗肿瘤疗效
更为重要的是，在同基因小鼠移植瘤实验中，无论是微卫星不稳定型（MSI）的MC-38模型还是微卫星稳定型的（MSS，对免疫治疗不敏感）CT-26模型下，化合物5i与PD-1抗体的联用均表现出明确的增效作用（抑瘤率从25-45%提升至75-76%，图4），部分动物出现肿瘤消退，展示出将“冷肿瘤”转换为“热肿瘤”的潜力。毒理学的初步研究表明，在550 mg/kg高剂量下，动物耐受性良好。目前，化合物5i已基本明确为候选药物，进入临床前研究。
相关成果近期发表在国际药物化学Top期刊Journal of Medicinal Chemistry 上，华中师范大学杨光富教授和黄伟副教授为论文的共同通讯作者，博士研究生王明书、王志正和硕士研究生李子龙为共同第一作者。
研究团队简介
黄伟博士现任华中师范大学化学学院副教授，主要从事小分子靶向药物的研究。近年来针对激酶和质子泵等类靶点，基于构象调控系列化策略和分布代谢协同导向策略，成功开发了5个临床前候选药物（PCC）。其中，抗肿瘤1类新药NP-01正在开展临床I期研究；抑酸1类新药SH-337即将完成临床前开发并提交IND申请。曾获中国青少年科技创新奖和江苏省高层次创新创业人才引进计划等资助，兼任湖北省药学会药物化学与抗生素专委会委员、秘书。
杨光富教授现任华中师范大学校学术委员会副主任、智能生物传感技术与健康国际联合研究中心主任、农药与化学生物学教育部重点实验室主任。长期从事绿色农药创制及其化学生物学研究，创制出全球第一个高粱地选择性除草剂喹草酮和吡唑喹草酯、氟苯醚酰胺等多个进入登记程序的农药候选新品种。曾获教育部自然科学一等奖、湖北省自然科学一等奖、侯德榜科技创新奖、药明康德生命化学研究奖及三农金桥奖。曾获国家杰出青年科学基金资助，入选中组部“万人计划”科技创新领军人才，被授予全国模范教师、全国优秀科技工作者等荣誉称号。所指导的博士学位论文中，获全国百篇优秀博士学位论文奖1项、提名奖2项。指导学生在第八届中国国际互联网+创新创业大赛中获国赛金奖1项、银奖1项。
Discovery of Macrocycle-based HPK1 Inhibitors for T-Cell-based Immunotherapy
Ming-Shu Wang, Zhi-Zheng Wang, Zi-Long Li, Yi Gong, Cheng-Xiang Duan, Qian-Hui Cheng, Wei Huang, and Guang-Fu Yang
https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.jmedchem.2c01551
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