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硒是人体必需的微量元素，研究表明硒参与体内多种酶的合成，参与机体抗氧化和能量代谢等过程，具有多种生物学功能，在提高免疫力、抗癌和辅助治疗心肌病、高血压和糖尿病等方面有重要的医理作用。机体缺硒会导致一些重要器官和机能的失调，是引发大骨节病、心肌病、溶血和癌症等疾病的主要原因。
中北大学化学工程与技术学院的高莉和环境与安全工程学院的赵英虎*等利用黑色素的优异性质，以黑芝麻黑色素为模板剂和还原剂制备黑色素-纳米硒；对黑色素-纳米硒在制备过程中的影响因素进行调控优化，并表征其结构和形貌，探讨黑色素-纳米硒的缓释特性、体外抗氧化能力，评价其对红细胞和内皮细胞EAhy926氧化损伤的保护作用，通过构建肺癌细胞A549模型和海虾致死实验，探讨其抑癌和生物相容性。与其他生物大分子物质作纳米硒合成的稳定剂和分散剂相比，黑芝麻黑色素不仅具有生物安全性，且性质稳定，广泛存在，在制备过程中能减少有机溶剂的使用，克服纳米硒合成原材料成本高、合成复杂、条件苛刻等缺点。因此，本研究黑色素-纳米硒合成是一种环保、绿色的方法，将为进一步拓宽黑色素和黑色素-纳米硒的生物活性及应用研究提供理论依据。
1、黑色素-纳米硒的制备
表征黑色素-纳米硒溶液双波长的选择
由图1可知，黑芝麻黑色素的最大吸收峰在218 nm处，在全波长范围内几乎均有吸收，而黑色素-纳米硒的紫外光谱图在218 nm波长处的吸收发生变化，在可见光范围内也均有改变，表明了黑色素-纳米硒的生成。据胶体粒径参数B=lg（A2/A1）/（lgλ1/lgλ2），其中A1、A2分别为在λ1和λ2处测得的吸光度。当在固定波长λ1、λ2处A2/A1的值保持不变时，表示胶体溶液粒径不变，处于稳定状态。其中背景干扰组分的吸光度选取必须准确，ΔA=0时才能完全消除背景组分干扰；两吸收波长的选取应尽量在光谱曲线斜率变化较小的波长处，以减小波长变化对吸光度的影响；两波长的选取应保证被测组分的吸光度有变化，以增加测定的准确率和灵敏度。因此选取黑色素在可见区的两等吸收波长λ1=539 nm、λ2=579 nm作为纳米硒溶液的测定波长，以排除黑色素光吸收对黑色素-纳米硒吸光度的影响，以A539nm/A579nm作为检测纳米硒粒径随反应条件变化的依据。
黑色素-纳米硒制备过程的影响因素分析
由图2a可知，与其他温度相比，在体系反应温度为40 ℃时，A 539nm /A 579nm 值最大，表明在此温度下，反应较迅速且充分，能制备得到粒径较小、分布均匀且较稳定的黑色素-纳米硒溶胶。当反应介质温度高于40 ℃时，A 539nm /A 579nm 值迅速下降，可能是由于温度升高加速了形成黑色素-纳米硒的运动，使黑色素-纳米硒颗粒发生了团聚，粒径逐渐变大。因此选择最佳反应温度为40 ℃。由图2b可知，反应时间对形成黑色素-纳米硒的粒径影响较明显，反应时间为5 h时，A 539nm /A 579nm 值最大，表明制备得到的纳米硒粒径最小。随着反应时间的延长，形成纳米硒的粒径趋于平缓，表明在反应时间为5h时，反应完成制备得到黑色素-纳米硒，且粒径缓慢下降。因此，选择最佳反应时间为5 h。由图2c可知，溶液pH值会影响形成黑色素-纳米硒颗粒的稳定性，当pH值处于临界等电点附近，形成的颗粒会发生聚集甚至沉淀；pH值的改变也可能使纳米粒子间的相互作用发生变化。当pH值为7时，制备得到的黑色素-纳米硒的A 539nm /A 579nm 值较大，表明黑色素-纳米硒的粒径较小；随着pH值增大，颗粒粒径变大，表明颗粒间发生了相互作用。而在溶液为强碱性（pH 12.5）时，可能由于黑色素能溶于碱性溶液而在酸性溶液中沉淀的性质，使黑色素-纳米硒的粒径突然发生变化。为了后续黑色素-纳米硒用于膳食补硒剂的研究，选择最佳反应pH值为7。
2、红外光谱表征结果分析
由图3可知，黑芝麻黑色素的特征吸收峰主要位于340～3000、2950～2850 cm -1 及1630～1400 cm -1 ，1593、1490 cm-1处为芳环C＝C的振动伸缩吸收峰；830～625 cm-1范围内为芳环取代区，吸收峰较弱表明芳环被取代，芳氢含量较少，形成了共轭体系；在3400～3200 cm-1处存在较强的缔合—OH伸缩振动吸收峰，1268 cm-1处较强吸收峰说明分子中存在羰基，两者一起证实了—COOH结构的存在；2926 cm-1和2848 cm-1处较弱的吸收峰是烷烃结构中C—H伸缩振动引起，另外在1402 cm-1处有较强的C—H弯曲振动吸收峰。黑色素-纳米硒在3400～3000、1500 cm-1左右及指纹区的吸收峰证实了黑色素的存在。黑色素-纳米硒在3400～3200 cm-1处较强的缔合—OH伸缩振动吸峰发生变化，羰基吸收峰也减弱；于1268 cm-1处羰基及1475～1000 cm-1处C—H弯曲振动吸收峰变化较大。表明了黑色素分子中的羧基及共轭体系可能参与了与二氧化硒的反应。
3、SEM表征结果分析
由图4a可得，黑芝麻黑色素呈立方体块状结构，结构较明显，表面无附着物且形貌较规则。如图4b～f所示，当黑色素与二氧化硒体积比为7∶5或8∶5时，制备得到的黑色素-纳米硒有一定的团聚现象发生。而当黑色素与二氧化硒溶液体积比为9∶5时，制备得到纳米硒分布均匀，分散性较好。当黑色素与二氧化硒溶液体积比为10∶5和11∶5时，过量黑色素被吸附到了黑色素-纳米硒表面，导致颗粒的团聚。因此，以黑色素还原制备黑色素-纳米硒的最佳黑色素与二氧化硒的体积比为9∶5。
4、动态光散射仪表征结果分析
由图5a可知，黑芝麻黑色素的粒径约为1.6 µm。由图5b可知，当黑色素与二氧化硒溶液体积比9∶5、反应pH 7、40 ℃反应5 h时，黑色素-纳米硒的粒径分布均匀，约为200 nm。黑色素-纳米硒的Zeta电位结果表明黑色素-纳米硒表面带负电荷（-36.7779 mV），可能是反应过程中生成的负离子吸附在其表面所致。一般认为Zeta电位的绝对值小于30 mV时，溶液体系会趋于不稳定。黑色素-纳米硒为36.7779 mV＞30 mV，表明制备得到的黑色素-纳米硒能稳定分布于水分散体系中。
5、XPS表征结果分析
黑色素-纳米硒的XPS表征结果如图6所示。参照文献[31-32]分析XPS结果，根据黑色素-纳米硒图谱中Se 3d峰位（Se峰值中最高的峰）54.73 eV确定样品中含有Se 0 （图6c），代表高价硒的Se 2p、2s和1s轨道均没有检测到光强度值，进一步说明Se 4+ 已被黑色素完全还原。
6、缓释结果分析
如图7所示，黑色素-纳米硒在模拟胃液环境中2 h内硒元素几乎无法释放，随着时间的延长，释放率不断提高，表明长时间酸处理，可能对其结构具有一定的破坏作用；而在模拟肠液中，黑色素-纳米硒可缓慢释放，在作用一段时间之后释放率维持在相同水平，具有较高的稳定性和长效缓释能力。相比酸不稳定的多酚-纳米硒在酸性环境中1 h内破坏纳米结构，壳聚糖-纳米硒体系硒元素几乎无法释放，黑色素-纳米硒在体外模拟肠液环境中具有一定的pH值稳定性和缓释性能，可为黑色素-纳米硒用作膳食补硒剂提供一定的理论基础，也为黑色素资源的深入研究和黑色素-纳米硒的制备提供了一定指导作用。
7、黑色素-纳米硒的体外抗氧化分析
由图8及表1所示，黑色素-纳米硒质量浓度为22.2 µg/mL时，对ABTS阳离子自由基的清除率已达92.4%；阳性对照组二氧化硒对ABTS阳离子自由基的清除率为51.6%，表明合成的黑色素-纳米硒对ABTS阳离子自由基的清除率高于无机硒。黑色素-纳米硒对ABTS阳离子自由基的半抑制浓度（IC 50 值）约为3.0 µg/mL，具有较强的抗氧化活性。综上所述，黑色素-纳米硒抗氧化活性显著高于无机硒。这一方面可能是因为黑色素本身就具有较强的抗氧化活性，也有可能是因为形成了纳米球，后续实验将继续探究具体原因。
8、黑色素-纳米硒对内皮细胞氧化损伤的保护作用分析
如图9a所示，二氧化硒具有较高的细胞毒性，细胞存活率低于30%；而黑芝麻黑色素和黑色素-纳米硒表现出很低的细胞毒性，不同质量浓度作用于EAhy926细胞存活率均在50%以上，且呈一定剂量关系。质量浓度为44.4 µg/mL时，黑色素-纳米硒处理组细胞存活率依然在80%以上。证明了黑色素-纳米硒对正常细胞的毒性较弱，具有良好的生物安全效应。
H 2 O 2 （浓度为0.5、1、2、4、8 µmol/L）作用于内皮细胞EAhy926一段时间（6、18、24 h），结果如图9b所示，H2O2能以时间和浓度依赖性显示对EAhy926的细胞毒性，考虑到模型建立的短暂性，最终选取2 µmol/L的H2O2与细胞EAhy926共孵育6 h进行后续实验，在此条件下细胞存活率在50%～70%之间（65%），可用于构建内皮细胞EAhy926的氧化损伤模型。
由图9c可知，黑色素-纳米硒能浓度依赖性有效抑制H2O2对细胞的氧化损伤作用，低剂量（2.775 µg/mL）组细胞存活率为63.7%，中剂量（11.1 µg/mL）组细胞存活率为75.6%，高剂量（44.4 µg/mL）黑色素-纳米硒与细胞EAhy926共孵育，细胞存活率高达85.1%，可明显提高细胞存活率，显著抑制H2O2对内皮细胞EAhy926的氧化损伤作用。
9、黑色素-纳米硒对红细胞溶血的保护作用分析
如图10a所示，随着H 2 O 2 浓度的变化，红细胞溶血率也发生变化，呈正相关关系。H2O2达到20 µmol/L以上时，与细胞作用1 h，溶血现象达到稳定。10 µmol/L H2O2处理红细胞1 h后的溶血率为55.35%，效果较显著，考虑实验过程中H2O2氧化损伤模型构建的时间，最终选取10 µmol/L H2O2处理红细胞1 h进行后续实验。
由图10b得出，黑色素-纳米硒（质量浓度为400、200、100、80、40、20、10、8 µg/mL）作用于红细胞时，其溶血率在10%左右，表明黑色素-纳米硒对红细胞几乎无毒害作用；而不同质量浓度二氧化硒溶液作用于红细胞时，溶血率均较高，一定程度上对细胞有毒。在红细胞的氧化损伤模型中，黑色素-纳米硒对H2O2引发的溶血具有明显抑制作用。当黑色素-纳米硒质量浓度在100 µg/mL以上时，红细胞溶血率可降到10%左右，表明经黑色素-纳米硒预处理的红细胞，能够减轻H2O2引发的细胞破裂溶血现象，降低氧化损伤。
10、黑色素-纳米硒抑制肺癌细胞A549分析
图11显示了不同质量浓度黑色素-纳米硒对肺癌细胞A549的抑制率，结合样品对内皮细胞存活率结果分析，二氧化硒对细胞具有一定的毒性作用，质量浓度越高，肺癌细胞A549存活率越低。随着黑色素-纳米硒质量浓度的增加，对肺癌细胞A549的抑制率也逐步上升，有显著的剂量抑制依赖性。黑色素-纳米硒质量浓度为44.4 µg/mL时，对肺癌细胞A549的抑制率达到了67.94%，表明黑色素-纳米硒能显著抑制肺癌细胞A549增殖，具有抗肺癌活性。
11、黑色素-纳米硒的海虾致死活性分析
海虾致死实验结果经计算得出，二氧化硒溶液的LC 50 为19.781 µg/mL，而黑色素-纳米硒的LC50为347.393 µg/mL。LC50值越大，表明样品对海虾的致死能力越弱。生物制备合成的黑色素-纳米硒LC50值远大于100 µg/mL，对海虾模型具有较弱的毒性作用，而二氧化硒对海虾具有中等程度的致死率。该海虾致死实验表明经生物合成法制备得到的黑色素-纳米硒安全性较高。
结论
以黑色素为原料，生物合成法制备黑色素-纳米硒，最佳工艺为：黑色素质量浓度0.3 mg/mL，二氧化硒质量浓度0.555 mg/mL，两者溶液体积比为9∶5，反应pH 7，避光恒温40 ℃、400 r/min磁力搅拌5 h。生物制备合成黑色素-纳米硒的过程中，黑色素分子中的羧基及共轭结构可能参与了反应；反应中Se 4+ 均被黑色素还原；制得的黑色素-纳米硒粒径分布均匀，约为200 nm，能稳定存在于水分散体系中。黑色素-纳米硒在一定程度上有良好的耐pH值能力，在体外模拟肠液环境中可缓慢释放，具有较高的稳定性和长效缓释能力。
黑色素-纳米硒的抗氧化活性显著高于二氧化硒，具有抑制红细胞溶血及内皮细胞EAhy926氧化损伤的能力，能抑制肺癌细胞A549增殖，且与黑色素-纳米硒剂量呈正相关，其较二氧化硒具有较弱的毒性作用。
本研究以黑芝麻黑色素为模板剂和还原剂，生物制备法还原制备得到了黑色素-纳米硒，并研究了其缓释性能、抗氧化能力、抑癌和生物相容性。之后研究中应进一步研究黑色素-纳米硒进入机体后的代谢途径及吸收形式，进一步分析其生物利用度，拓展黑色素-纳米硒在食品及生物医学等方面的应用。
01.
第一作者简介
高莉，女，1980年出生，博士，副教授，硕士生导师，中北大学化学工程与技术学院生物工程专业教师，山西医科大学生物学博士后，2018年-2019年加州大学圣地亚哥分校访问学者。主要研究方向为：研究农产品中有效成分的分离、修饰及构效关系，农产品精深加工，农产品资源的生物加工技术。近年来，主持和参与多项科研项目，主持山西省回国留学人员科研资助项目、山西省重点研发计划项目、山西省高等学校科技创新项目、山西省青年自然科学基金、山西省科研设备购置专项等纵向及横向课题10余项。以第一发明人申请国家发明专利13项，已授权7项。在国内外学术期刊上发表论文40余篇，参与编写中文著作1部，英文著作1部，教材1部。
02.
通信作者简介
赵英虎，男，1980年出生，博士，讲师，中北大学环境与安全工程学院教师。主要研究方向为：食品配料与添加剂生物制造，食品快检技术及食品安全公共服务。近年来，承担和参与多项省部级科研项目和企业横向项目。在国内外学术期刊上发表论文30余篇，授权国家发明专利5项，参与编写教材2部。
本文《黑色素-纳米硒的制备及其性质》来源于《食品科学》2023年44卷6期97-106页，作者：高莉，任燕玲，刘琳琳，徐宏宇，郝瑞，赵英虎。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20220412-134。点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。
图片来源于文章原文及摄图网。
为构建多元化食物供给体系并兼顾生态环境保护，并形成以生物多样性保护促进食品生产的可持续性，北京食品科学研究院和中国食品杂志社将与北方民族大学、宁夏大学、皖西学院、宿州学院、滁州学院、黄山学院于 2023年5月13-14日在中国宁夏银川 共同举办“ 生态保护与食品可持续发展国际研讨会 ”。本届研讨会将围绕新资源食品挖掘、动植物、微生物可替代蛋白、食用菌等食物资源的开发现状、重要创新进展及存在的问题开展研讨，探讨未来食品发展方向，通过展示我国生态保护与食品可持续发展等领域的最新科研成果，搭建科研单位与企业产学研结合的平台，共同促进我国食品产业发展快速踏入新里程。
Food Science of Animal Products（ISSN: 2958-4124, e-ISSN : 2958-3780）是一本国际同行评议、开放获取的期刊，由北京食品科学研究院、中国肉类食品综合研究中心主办，中国食品杂志社《食品科学》编辑团队运营，属于食品科学与技术学科，旨在报道动物源食品领域最新研究成果，涉及肉、水产、乳、蛋、动物内脏、食用昆虫等原料，研究内容包括食物原料品质、加工特性，营养成分、活性物质与人类健康的关系，产品风味及感官特性，加工或烹饪中有害物质的控制，产品保鲜、贮藏与包装，微生物及发酵，非法药物残留及食品安全检测，真实性鉴别，细胞培育肉，法规标准等。
投稿网址：
https://www.sciopen.com/journal/2958-4124
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